人胰島細胞分離液實驗方法 產品編號：ISC2011H 產品名稱：人胰島細胞分離液試劑盒 本品用于分離人胰島細胞? 技術文檔編號：TBD0048SOP 【產品規格】 2×200ml/Kit 【產品組成】 為方便廣大用戶使用，試劑內容如下： 名稱 產品編號 規格 A 分離液 1 200ml B 分離液 2 200ml C 勻漿沖洗液（贈品） F2013TBD 200ml D 樣本稀釋液（贈品） 2010C1119 200ml E 清洗液（贈品） 2010X1118 200ml F 洗滌液（贈品） TBDTM-W 200ml G 說明書 1 份 【實驗前準備】 1.適用儀器 最大離心力可達 1200g 的水平轉子離心機 2.無菌硅化離心管 序號 產品名稱 產品貨號 規格 1 無菌硅化離心管/10ml（隨試劑盒附贈 5 支） TUB2015 100 支/包 【組織樣本的制備】 1.取組織塊稱重后，用眼科剪刀無菌操作，將組織剪成小塊。 2.將組織塊放在 70μm 細胞篩網（產品編號：TBDTM-SC，隨試劑盒附贈 5 個）上，用研磨器反復研磨，邊研磨邊加入勻漿沖洗液（以 0.1g 組織為例，約加 5-8ml），使細胞全部通過篩網滴到離心管中。 3.棄去篩網，組織研磨液經 450g，離心 10min，棄上清。 4.用樣本稀釋液重懸組織細胞，將細胞懸液細胞濃度調整為 2×108–1×109/ml（以 0.1g 組織為例，約使用 1ml 樣本稀釋液重懸細胞），備用。 【檢驗方法】 全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。 1.取一支無菌硅化離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:2，試劑總量與稀釋后的樣本量相等，如組織單細胞懸液為 5ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：2ml），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。 2.用吸管小心吸取組織懸液樣本加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注：根據組織懸液樣本量確定離心條件，樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果）。 3.離心后，此時離心管中由上至下分為五層。第一層為稀釋液層。第二層分離液 2 層。第三環狀乳白色目的細胞層。第四層為分離液 1 層。第五層為紅細胞層。 4.用吸管小心吸取第二層試劑 D 層和第三層環狀乳白色細胞層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 5-10ml 洗滌液（產品編號：TBDTM-W），混勻細胞。 5.400g，離心 10min。 6.棄上清。 7.用吸管以 5ml 清洗液（產品編號：2010X1118）重懸所得細胞。 8.250g，離心 10min。 9.重復 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續實驗所需相應液體重懸細胞。【差異貼壁法純化細胞】 （1）用胰島細胞無血清培養基（產品編號：TBD20180028）或胰島細胞完全培養基（產 品編號：TBD20180058）以 1.5-3×106 個/ml 的密度重懸細胞，將細胞鋪于一次性細胞 板或細胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養箱中進行貼壁培養。 （2）2-4 小時內貼壁的為巨噬細胞前體（俗稱為單核細胞）。 （3）10-24 小時內貼壁的單個核細胞為內皮、內皮祖細胞、干細胞。 （4）不貼壁的為淋巴細胞。 注： a)無血清培養基中不含任何動物成分，為得到更佳培養效果可添加 10%自體血漿或2-8% 經篩選的胎牛血清。 b)完全培養基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養的目的細胞而定）。 c)由于每種細胞的貼壁時間存在差異可將所得細胞分開已達簡單的純化目的，此法成本相對較低。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選。 【注意事項】 1.全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得最佳的實驗結果，最好在取樣 2h 內進行實驗，樣品存放時間越長，細胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。 2.本實驗最好不要使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離心管及未經堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。 3.吸取過多的目的細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數量增加。 4.如所實驗后細胞得率或活性過低，請聯系技術以尋求幫助。 【儲存條件及有效期】 常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟 封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。 【參考值（參考范圍）】 本實驗胰島細胞提取率大于 80%。 【相關實驗技術方案】 1.組織單細胞懸液制備技術。 2.所獲得胰島細胞的培養技術。 3.所獲得胰島細胞的核酸提取技術。 4.所獲得胰島細胞的鑒定方法A.流式細胞技術B.免疫組化技術 C.原位雜交技術 D.PCR 技術 【可能存在的問題及解決方法】 1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示： 出現情況 出現原因 建議解決方案 離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層 轉速過小或離心時間過短 適當增減轉速 離心后目的細胞存在于分離液中 轉速過大或離心時間過長 離心后白環層彌散 細胞密度過大 調整細胞密度 離心后白環層太淺或看不見 細胞密度過小 2.本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關。不同地區客戶可根據當地情況對離心條件進行適當調整。建議對離心條件進行調整時，恒定離心時間，對離心轉速進行調整。 3.本分離液依照國際標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產同類產品略有不同，可 能出現紅細胞沉降不完全的情況，可以適當加大離心轉速。 注：在對離心條件進行調整時，離心轉速的加減以 50-100g 為基數，直至達到最佳分離效果， 離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。