呋喃西林代謝物快速檢測試劑盒說明書

呋喃西林代謝物快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物呋喃西林代謝物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃西林代謝物抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色， 樣本吸光值與其所含殘留物呋喃西林代謝物的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物呋喃西林代謝物的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度： 0.02ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min~15min
u 樣本檢測下限
組  織 ·······································   0.1ppb
雞  蛋 ·······································   0.1ppb

u 交叉反應(yīng)率

呋喃西林代謝物 100%
呋喃唑酮代謝物 ＜0.1%
呋喃妥因代謝物 ＜0.1%
 

5	底物A 液	7ml	白色帽
6	底物B 液	7ml	黑色帽
7	終止液	7ml	黃色帽
8	20X 濃縮洗滌液	40ml	白色帽
9	2X 濃縮復(fù)溶液	50ml	透明帽
10	衍生化試劑	10ml	黑色帽

 

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋
微量移液器：單道 20~200μl、單道 100~1000μl、多道 30~300 μl
試 劑：氫氧化鈉、K₂HPO₄·3H₂O、正己烷、乙酸乙酯、濃 HCl

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知
（a） 實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b） 實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈， 必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

u 樣本前處理需配制

配液 1 0.1M K HPO 溶液：
2、 在 70℃水浴鍋中孵育 20min；
3、 分別加入 5ml 0.1M K₂HPO₄ 溶液，0.4ml 1M NaOH 溶液和 6ml 乙酸乙酯，充分振蕩 30s；
4、 在室溫下（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min
（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足   3ml        ，在80      ℃  水浴孵育樣品10min      并重復(fù)離心；或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心）；
5、 取出 3ml 的乙酸乙酯到另一個容器中于 50℃氮氣/空氣吹干。
6、 用 2ml 正己烷溶解干燥物，再加入 1ml 樣本復(fù)溶液充分混合 30s；在室溫下 4000r/min 以上離心    10min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，       重復(fù)離心）；
7、 取 50μl 下層用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 2 倍
此方法與呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、         呋喃妥因代謝物、氯霉素試劑盒可合一處理。

六、 酶標免疫分析程序:

u 測定前應(yīng)須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫
（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。
3、 在ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定
個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標準品/樣品 50μl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物 50μl/孔，然后再加入抗體工作液 50μl/ 孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應(yīng) 30min。
6、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250μl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 顯色：加入底物A 液 50μl/孔，再加入底物 B 液 50μl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色 15min。
8、 測定：加入終止液 50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方
法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含呋喃西林代謝物量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3， 樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是： 0ppb 為 2.243；0.02ppb 為 1.816；0.06ppb 為 1.415；
0.18ppb 為 0.74；0.54ppb 為 0.313；1.62ppb 為 0.155。

2 4 程序中的要點。
則樣本 1 的濃度范圍是 0.54ppb～1.62ppb；樣本 2

呋喃它酮代謝物 ＜0.1%

u 樣本回收率

組  織 95%±25%
雞  蛋 95%±25%

三、試劑盒組成

稱 11.4g K₂HPO₄·3H₂O 加去離子水溶解定溶至 500ml。
配液 2 1M HCl 溶液：
取 8.6ml 濃HCl 加去離子水定容至 100ml。配液 3 1M NaOH 溶液：
稱 4g NaOH 加去離子水定容至 100ml
配液 4 樣本復(fù)溶液：
將 2X 濃縮復(fù)溶液用去離子水按 1：1 稀釋。

u 樣本處理

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～
25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于 2-8℃。

的濃度范圍是 0.06ppb～0.18ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃西林代謝物實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即
B

 

肌肉組織、雞蛋樣本處理方法

3、 配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去
離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份
百分吸光率（%）＝
×100%
B₀

1、 稱取 1±0.05g 的均質(zhì)物，分別加入 4ml 的蒸餾
水，0.5ml 1M HCl 溶液和 100μl 衍生化試劑， 充分振蕩 2min；
去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值B₀—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算