線粒體復(fù)合體Ⅱ試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
線粒體復(fù)合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同時(shí)輔基FAD還原為FADH₂，后者進(jìn)一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q，是呼吸電子傳遞鏈的支路。
測(cè)定原理：
復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進(jìn)一步還原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通過(guò)檢測(cè)2,6-二氯吲哚酚的減少速率來(lái)計(jì)算該酶活性。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體 50mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：液體 10mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：液體 0.75mL×1 支，-20℃保存；
試劑四：液體 12.5mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；
試劑六：液體 1.25mL×1 瓶，4℃保存；
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿 600g，4℃離心5min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅱ（此步可選做）。
5、步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅱ酶活性測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至605nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）工作液的配制：臨用前把試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑4℃可保存一周；
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、25μL試劑六和200μL工作液，立即混勻，記錄605nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
 
復(fù)合體Ⅱ活力單位的計(jì)算：
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=559×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)
÷T=113×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.226×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.35×10 ^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L/ mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T
=1118×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=226×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.452×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.35×10 ^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10 ⁴ L/ mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。